IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR-Test

Testvalidation und Kreuzspezifitätsstudien

IDEXX Reference Laboratories hat einen real-time PCR-Test entwickelt, um SARS-CoV-2 auf Grundlage einer einzigartigen Zuordnung zu den veröffentlichten Gensequenzen des Virus aus humanen COVID-19-Infektionen zu identifizieren. Der IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR-Test hat alle wissenschaftlichen Anforderungen an die Validierung der Analysenmethode erfüllt. Die Spezifitätsstudien zeigten keine Kreuzreaktivität des neuen PCR-Tests mit Coronaviren allgemein, die Haustiere infizieren. Desgleichen wurde gezeigt, dass mit allen IDEXX RealPCR-Tests für tierpathogene Coronaviren synthetische COVID-19-Nukleinsäure nicht nachweisbar ist. Die IDEXX RealPCR-Tests werden auf einer standardisierten real-time-PCR-Plattform im Labor für Molekulardiagnostik in West Sacramento, Kalifornien, konzipiert und durchgeführt. Mehr als 3.500 Proben von Hunden, Katzen und Pferden wurden mit dem neuen IDEXX SARS-CoV-2 RealPCR-Test untersucht. Diese Proben wurden über einen Zeitraum von vier Wochen beginnend am 14. Februar 2020 aus den USA und aus Südkorea in das Labor eingesendet. Darunter befanden sich auch Proben aus Regionen, in denen derzeit menschliche COVID-19-Fälle verzeichnet werden, wie die Gegend um Seattle. Darüber hinaus wurden die Proben parallel mit drei publizierten Testsystemen der Zentren für Seuchenkontrolle und -prävention (Centers of Disease Control and Prevention, CDC) untersucht. Bisher wurden in keiner der Proben positive Ergebnisse nachgewiesen. Das Monitoring von Hunde- und Katzenproben, die für die Diagnostik mittels respiratorischer RealPCR-Profile eingeschickt werden, wird fortgeführt und auf andere Regionen der Welt ausgeweitet.

Assaydesign und -validierung

Der IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR-Test zielt auf den Nachweis des gleichen Nukleokapsidgens ab, wie auch in den CDC-Testsystemen verwendet, und wurde an die Analyseanforderungen unserer standardisierten Plattform angepasst. Die Auswahl dieses Zielgens basierte auf umfangreichen Sequenzanalysen, die einen hohen Konservierungsgrad aufzeigten. Die Validierung des Tests umfasste im ersten Schritt eine BLAST-Sequenzanalyse von mehr als 300 öffentlich verfügbaren SARS-CoV-2 Gensequenzen. Im zweiten Schritt wurde eine synthetische Positivkontrolle zur funktionalen Bewertung der Testsensitivität und -spezifität herangezogen. Die Anforderungen an die Leistung des neuen Assays, die die Amplifizierungseffizienz, ein stabiles Signal-Rausch-Verhältnis während der Zielgenvermehrung, und die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Testlaufs und zwischen verschiedenen Läufen (Intraassay- und Interassay-Varianz) umfasst, wurden allesamt erfüllt. Darüber hinaus implementierte IDEXX die drei CDC-Testsysteme, die zwecks Bestätigung parallel mit dem IDEXX-Assay durchgeführt wurden (ursprüngliche Veröffentlichung am 24. Januar 2020).1,2

Zur Überprüfung der Testspezifität wurden PCR-positive Untersuchungsmaterialien zum caninen respiratorischen Coronavirus, zum caninen und felinen enteralen Coronavirus und zum equinen enteralen Coronavirus, die zur Diagnostik an IDEXX eingeschickt wurden, ebenfalls mit allen vier SARS-CoV-2-Assays getestet. Die drei CDC-Assays und das IDEXX SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR-Assay wurden an dieser Population negativ auf andere Coronaviren getestet. Folgende Kontrollen wurden während der Validation der real-time PCR und des Screenings durchgeführt: 

  • Negative Extraktionskontrolle (NEC): Alle negativen Extraktionskontrollen waren PCR-negativ.
  • Präanalytische Probenqualitätskontrolle mit dem real-time PCR-Assay für ein endogenes Kontrollgen. Alle Proben haben unabhängig davon, ob sie PCR-positiv oder negativ waren, die Probenqualitätskontrolle bestanden.
  • PCR-Negativkontrollen: Alle PCR-Negativkontrollen waren negativ.
  • PCR-Positivkontrollen: Alle PCR-Positivkontrollen (synthetische Positivkontrolle) wurden positiv getestet.
  • Überwachung der Umgebungskontamination: Alle Proben von den unterschiedlichen Arbeitsbereichen innerhalb des PCR-Labors waren in Bezug auf die Kontaminationsüberwachung negativ.

 

Screeningmethodik

Es wurden zufällig ausgewählte Proben aus den über das Diagnostikangebot von IDEXX für die Durchführung einer real-time PCR eingereichten Untersuchungsmaterialien zu caninen, felinen und equinen respiratorischen Erkrankungen sowie feliner, caniner und equiner Diarrhoe verwendet. Die für das Screening verwendeten Proben umfassten Abstriche (meist tiefe pharyngeale Abstriche und konjunktivale Abstriche) sowie Kotproben. Die mehr als 3.500 Proben, die zwischen dem 14. Februar und dem 12. März gescreent wurden, lassen sich wie folgt beschreiben:

  • Die gescreenten Proben stammten aus allen 50 Bundesstaaten der USA und aus Südkorea.
  • 55 % der Proben stammten von Kaninchen, 41 % stammten von Katzen, 4 % stammten von Pferden.
  • 77 % der Proben stammten aus Atemwegen, 23 % aus Kotproben.

 

Literatur

  1. Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use. CDC publication CDC-006-00019, Revision: 02. www.fda.gov/media/134922/download. Verfügbar seit 15. März 2020. Zugriff am Montag, 16. März 2020.
  2. Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. Research Use Only Real-Time RT-PCR Protocol for Identification of 2019-nCoV. www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html. Aktualisiert am 14. März 2020. Zugriff am Montag, 16. März 2020.